Reacción en cadena de la polimerasa
Clonación molecular
1. CLONACIÓN
MOLECULAR:
Objetivo
Aislar un gen o secuencia de ADN y amplificarlo en cantidades
suficientes que permitan el estudio
transferencia de una secuencia de ADN de interés a una célula de un MOS
Se cultiva el MOS para reproducir la secuencia de ADN junto con su
propio ADN
Clon: cada MOS
individual procede de una única cel. Original y contiene el mismo segmento
transferido de ADN
Clonación molecular: proceso de
generación de grandes cantidades de la secuencia de interés.
2. ENZIMAS
DE RESTRICCIÓN
(Endonucleasas de
restricción bacteriana)
reconocen secuencias de doble cadena específicas del ADN y los escinde
a nivel de los elementos fosfodiéster de la doble hélice.
Localización sitios de corte
- Opuestos à cadenas de ADN
con extremos romos – Aluf Ball
- Separadas por
pocas bases en cualquier dirección à resaltes
laterales en los extremos 5´ o 3´à extremos
cohesivos – EcoRI HindIII
EcoRI – Enzima que corta en 5´-GAATTC-3
3. VECTORES
Vector: molécula de ADN
que puede replicarse de manera autónoma en el huésped
- Cel. Levadura
- Bacterias
Inserción de ADN humano en un vector gracias a ADN ligasa à la nueva
molécula se introduce en un huésped bacteriano à propagación del
fragmento insertado junto con la molécula vector
Tecnología de ADN recombinante: moléculas de ADN de orígenes distintos, fragmento de humano y de vector
Vector más utilizado à PLASMIDOS
Plásmidos: Moléculas
naturales de ADN circular de doble cadena en bacterias y levaduras. Se
mantienen separados y se replican de forma independiente de los cromosomas del
mismo MOS
Contienen genes que confieren resistencia a los antibióticos y pueden
transmitirse
Para la clonación
molecular…
-
Pequeños
-
3 componentes:
I.
origen de replicación (para replicación en E. Coli o levaduras)
II.
uno o más marcadores (un gen que confiere resistencia a antibioticos)
III.
uno o mas sitios de restricción que pueden ser cortados y utilizados
para la ligación de moléculas extrañas de ADN.
Plásmidos útiles para clonación molecular utilizan…
BAC à Cromosoma bacteriano artificial
Desarrollo de la tecnología BAC: para conseguir insertos grandes que
pudieran permanecer estables y se replicaran fielmente al propagarse en el
huésped bacteriano
Permitieron la participación del genoma humano completo en fragmentos
de tamaño manejable y adecuado para la secuenciación.
4. GENOTECAS
Genoteca: colección de
clones recombinantes cada uno de los cuales contiene un vector al que se ha
insertado un fragmento diferente de ADN
derivado del ADN o el ARN totales de una molécula o tejido
Genotecas
genómicas: contiene fragmentos de ADN genómico generados por digestión parcial
con enzimas de restricción. Digestión parcial por cantidades limitantes de
enzimas.
Genotecas de
cADN: preferibles a las Genotecas genómicas porque
I.
el clon obtenido solo tiene los exones de un gen así que es la representación directa de la
secuencia codificante de un gen, sin intrones y secuencias promotoras
II.
los transcritos pueden tener diferencias, lo que indica que se están
utilizando promotores o sitios de poliadenilación alternativos, o corte y
empalme en sitios diferentes. Los exones pueden quedar incluidos o excluidos en
los transcritos
III.
el uso de un mRNA se enriquece por las secuencias derivadas de un gen
específico que se expresan en un solo tejido
Genoteca de cADN de musculo o
hígado es una buena fuente de clones para genes que se expresan exclusivamente
en estos tejidos.
Solo contiene los exones de un gen
No proporciona el tamaño o numero de exones ni la secuencia de lugares
de empalme
La clonación esta basada en la transcriptasa inversa
Vectores de
expresión: contienen señales de traducción y transcripción para el cDNA de
longitud completa para producir la proteína que codifica
5. CRIBADO DE GENOTECAS A TRAVÉS DE LA HIBRIDACIÓN CON SONDAS
DE AC. NUCLEICOS
cribado: separación de elementos de diferentes tamaños
una ves construida la Genoteca
identificación del clon que tiene la secuencia de interés
Cribado de la Genoteca: proceso que permite la identificación del clon que contiene el inserto
de interés à mediante la
técnica de hibridación de ac. Nucleicos
La secuencia diana en una mezcla de ac. Nucleicos es evaluada respecto
a su capacidad para formar emparejamientos estables con un fragmento de ADN o
ARN cuya secuencia es reconocida à la sonda
La sonda es marcada con un trazador radioactivo
Sonda complementaria con secuencia diana à forma molécula
estable de doble cadena
La secuencia diana es marcada
Marcadores: fósforo 32
La fluorescencia emitida por la sonda s captada por fotografía digital
Métodos
de análisis de los ac. Nucleicos
Electroforesis en gel: para separar la
moléculas de ADN o ARN según su tamaño
Transferencia de southern
Permite la detección y el análisis de un subconjunto de fragmentos de
ADN de interés por acción de las enzimas de restricción
Método estándar para analizar fragmentos de ADN generados por la
digestión de enzimas de restricción
1.
se aisla el ADN: cualquier cel. Del cuerpo puede utilizarse como
fuente, excepto eritrocitos maduros
a. de un px: se
prepara ADN genómico de los linfocitos
b. 10 ml bastan
2. colocados en
agarosa en la parte superior del gel
3. electroforesis en
gel de agarosa
4. se tiñe con
colorante fluorescente: bromuro de
etidio
5. fragmentos
pequeños: parte inferior / grandes: superior
6. el ADN parece una
extensión porque son muchos fragmentos
7. ADN de doble
cadena desnaturalizados, se quedan sin cadena complementaria
8. Las moléculas son
transferidas desde el gel a un papel filtro (por transferencia y capilaridad) à transferencia southern
9. Para identificar
se incuba con filtro y sonda en
condiciones que favorezcan el emparejamiento de moléculas complementarias
10. El filtro se
expone a una placa de rayos x para ver los fragmentos hibridados
La capacidad para detectar mutaciones es limitada, ya que tienen que
ser mutaciones apreciables (deleción o inserción de tamaño grande)
Análisis con sondas de
oligonucleótidos con especificidad de alelo
Para ver mutaciones mínimas (que afecta solo a una base, pequeña
inserción o deleción):
-
anemia falciforme
-
fibrosis quística
su menor longitud de la sonda lo hace más sensible
un oligonucleótido con especificidad de alelo (ASO) presenta
hibridación solo con la secuencia complementaria mutante
puede existir una mutación en
otro lugar donde no sea examinado por el ASO
Transferencia de nothern o de ARN
Equivalente a la southern pero de ARN
Determinar el tamaño y la abundancia de un mRNA de un determinado gen
No se pueden cortar con enzimas de restricción
Se puede separar por electroforesis porque los transcritos son de
distintas longitudes
Puede ser necesaria su desnaturalización para evitar el emparejamiento de
bases
Reacción
en cadena de la polimerasa PCR
Para ADN o ARN
Amplificación enzimática de un fragmento de ADN (diana) localizado
entre 2 oligonucleótidos cebadores
Se usa la ADN polimerasa para sintetizar dos nuevas cadenas de ADN
usando como plantilla la secuencia que se localiza entre los cebadores
Las cadenas recién sintetizadas son complementarias y se puede formar
una segunda copia de la diana original.
Amplificación por:
a) desnaturalización
con calor
b) hibridación de
cebadores
c) síntesis
enzimática de ADN
la síntesis se detiene hasta que desaparecen los sustratos: cebador,
desoxinucleótidos
RT-PCR: PCR con
transcriptasa inversa à para análisis de
ARN
a) primero se
sintetiza un cADN de cadena única a partir del mRNA de interés con la
transcriptasa inversa utilizada en Genotecas de clones de cDNA
pueden efectuarse análisis con pocas células obtenidas
PCR Cuantitativa: para determinar
la cantidad de una secuencia de ADN en una muestra
PCR en tiempo
real: para cuantificar cantidades pequeñas de un ADN o un ARN concretos
existentes en una muestra (A), en relación con una muestra control (B) à los dos
segmentos deben ser paralelos
Análisis
de secuencias de DNA
Secuenciación de Sanger
Utiliza ddA, ddC, ddG, ddT porque carecen de un grupo hidroxilo
3´terminalen su desoxirribosa
Un fragmento de DNA que será secuenciado se usa como plantilla para la
síntesis de ADN cebado por un oligonucleótido corto. La DNA de la polimerasa sigue la secuencia de la
plantilla, ampliando el cebador e incorporando nucleótidos
Para obtener información…
1)
se añaden
reacciones de secuenciación análogos dideoxi con los nucleótidos
2)
cada análogo se
marca con colorante fluorescente à cada uno tiene una luz
3)
la polimerasa
incorpora un nucleótido à extensión
4)
base dideoxi à interrumpe la síntesis
5)
las cadenas son
separadas con electroforesis
Técnicas con
método de imagen digital de los nucleótidos marcados con fluorescencia
Hibridación in situ fluorescente (FISH)
en los cromosomas
Hibridación de
sondas marcadas con colorantes fluorescentes con el ADN contenido en los
cromosomas e inmovilizado en portaobjetos para la visualización
Se llama FISH
porque el DNA de los cromosomas en metafase es desnaturalizado ahí mismo (in
situ) para exponer las dos cadenas de ADN à permite que una sonda marcada se hibride con el ADN cromosómico à se presenta al microscopio con luz
Sondas de pintado cromosómico: cuando se analiza un cromosoma
Cariotipado espectral: combinación de sondas en FISH de los cromosomas en metafase
Detecta
cromosomas anómalos: deleciones, duplicaciones y translocaciones.
VARIACIÓN
GENÉTICA EN POBLACIONES: MUTACIÓN Y POLIMORFISMO
Mutación: cualquier cambio en la secuencia de un nucleótido u organización del DNA
3 categorías:
-
mutaciones
genómicas: las que afectan el núm. Cromosomas en la cel.
Aneuploidías à mutaciones más frecuentes
-
Mutaciones
cromosómicas: las que afectan la estructura de un cromosoma à duplicaciones o
triplicaciones parciales, deleciones, inversiones, translocaciones
-
Mutaciones
génicas: alteran genes concretos
Trisomía 21,
sustitución de pares de bases, inserciones y deleciones
2 mecanismos para
producirlas: errores durante el proceso de replicación / fallo en la reparación
del ADN dañado
-
Aneuploidías: alteraciones el
núm. De cromosomas intactos que se originan de errores en la segregación de los
cromosomas durante la mitosis o meiosis
-
Mosaicismo
somático: las mutaciones somáticas se producen al azar , no pueden ser
transmitidas a la sig. Generación
Errores en la replicación del ADN
Reparación del daño del ADN
Tipos de mutaciones y sus consecuencias
Sustituciones de nucleótidos
Mutaciones de
cambio del sentido
Puntual: un solo nucleótido
De cambio de sentido: sustitución de un aminoácido por otro
Mutaciones que
generan una terminación prematura de la traducción
Sin sentido: mutaciones puntuales que causan la sustitución del codón
normal por un aminoácido en uno de los 3 codones de terminación
Mutaciones del
procesamiento del RNA
Mutaciones que impiden el ciclo normal de corte y empalme del ARN con
una secuencia de nucleótidos en la unión exón-intrón (sitio donante 5´) o
(sitio aceptante 3’).
Sustitución de bases del intrón
Puntos críticos
de mutación
Transiciones: sustitución de una purina por otra (A-G) o una pirimida
por otra (C-T)
Transversión: sustitución de una purina –pirimida o viceversa
Deleciones e inserciones
Las deleciones se asocian a un síndrome de genes contiguos y son muy
pequeñas para analizarlas
Las translocaciones intercromosómicas se detectan mejor con cariotipo
espectral
Pequeñas
Mutaciones de cambio de marco de lectura: cuando el núm. De bases no es un núm. Entero
de codones (3) y ocurre una secuencia codificante el marco de lectura se
altera. Se crea una secuencia diferente de codones, que codifica ac. Anormales
seguidos de un codón de terminación en el marco cambiado
Si el núm. De pares de bases es múltiplo de 3 no se produce un cambio
de marco
Grandes
Inserción de grandes cantidades de DNA
Inserción de secuencias 1.1:
Familia L1 en el genoma humano son capaces de causar enfermedad por
mutagénesis de inserción
Efectos de
recombinación
Recombinación entre cromosomas mal apareados o entre 2 cromátidas
hermanas ocasiona deleción o duplicación génica
Apareamiento anormal de y recombinación de entre 2 secuencias repetidas
similares en una sola cadena de DNA
Hemofilia A à Recombinación
que invierte exones
Mutaciones dinámicas
Amplificación de secuencias repetidas de trinucleótidos
Hungtintong Sx. X
frágil
Las mutaciones
pueden expandirse durante la gametogénesis
Nomenclatura uniforma de las
mutaciones
Cuadro
Tasas de mutación en la línea
germinal en seres humanos
Las tasas de
mutación de un gen suele expresarse como el núm. De nuevas mutaciones por locus
por generación
Deriva genética: cambio aleatorio en la frecuencia de alelos de una generación a otra
Desviaciones del equilibrio Hardy-
Weinberg
-
Apareamiento
aleatorio
-
Endogamia
-
Emparejamiento
selectivo
-
Población de poco
tamaño à por deriva genética
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